合理的實(shí)驗(yàn)室分區(qū):
實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)用品,包括移液器等應(yīng)專用。如有可能,應(yīng)在裝有紫外燈的層流式工作臺(tái)(如生物安全柜、超凈工作臺(tái))內(nèi),吸加PCR試劑,工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR專業(yè)用的微量離心機(jī)、一次性手套、各量程的移液器和其他必須物品。
正確的實(shí)驗(yàn)操作:
吸加PCR試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按要求進(jìn)行,吸樣要慢,盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
實(shí)驗(yàn)的過程中應(yīng)勤換手套,在進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后,都應(yīng)及時(shí)更換手套。
裝有PCR試劑的微量離心管在打開之前應(yīng)先做瞬時(shí)離心(約10s),將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,從而減少污染手套或加樣器的機(jī)會(huì)。開管動(dòng)作要輕,以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠,造成污染。
在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí),應(yīng)制備主反應(yīng)混合液,再分裝至PCR反應(yīng)管,最后添加樣品核酸模板,以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。
實(shí)驗(yàn)器具和試劑:
實(shí)驗(yàn)室自己配置的試劑,如去離子水、緩沖液等,在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或過濾除菌。
分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,以減少重復(fù)取樣次數(shù),并置于-20℃保存,適當(dāng)時(shí),最好做到專人專用。另外,PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱。
所有吸頭、反應(yīng)管等應(yīng)一次性使用,使用之前,都應(yīng)經(jīng)過高壓處理。若條件允許,最好使用帶濾器的槍頭。各工作區(qū)內(nèi)的移液器要有標(biāo)識(shí),應(yīng)固定使用用途,不能交叉使用。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定,實(shí)驗(yàn)中至少應(yīng):
設(shè)置目標(biāo)DNA陽性對(duì)照反應(yīng)。對(duì)靶序列所作的適當(dāng)?shù)南♂尮ぷ鲬?yīng)于實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)別的位置進(jìn)行,這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實(shí)驗(yàn)室中專門進(jìn)行PCR的位置。
設(shè)置PCR試劑陰性對(duì)照和目標(biāo)DNA陰性對(duì)照反應(yīng)。
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